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Gendiagnostik

PCR in der medizinischen Diagnostik

Die Anwendung der Polymerase-Ketten-Reaktion in der medizinischen Labor-Diagnostik ist das Thema des Kurses. Neben der Einführung in PCR, DNA-Aufbau, Polymorphismen und Mutationen werden Sie die Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion an zwei konkreten Beispielen kennenlernen.

Einmal zeigen wir Ihnen auf, wie das PCR-Design durchgeführt werden muss, um Pathogene mittels PCR in Probenmaterial nachzuweisen. Dabei legen wir besonderen Wert auf die zuverlässige Bestimmung der Nachweisgrenze (limit of detection) und die Spezifität der Reaktion.

Im zweiten Beispiel werden Sie anhand der Lactose-Intoleranz des Menschen den Aufbau einer PCR-basierten Genotypisierungsmethode durchführen. Zu diesem Thema werden Sie sowohl praktische Übungen wie Primer-Design als auch die entsprechenden Laborexperimente durchführen.


Im Kurs werden Sie dazu die DNA-Sequenzen aus Datenbanken suchen, Primer für diese Analyse designen, die Pipettierpläne erstellen und das PCR durchführen. Anschliessend vergleichen wir die unterschiedlichen Möglichkeiten der Genotypisierung.  Zum Abschluss des Kurses werden Ihre Proben mittels Restriktions-Spaltung und Gelelektrophorese analysiert und der Genotyp bestimmt. Themen wie, die Validierung Ihres PCR-Assays werden ebenso besprochen wie die Überprüfung Ihrer Daten bzgl. des Hardy-Weinberg-Gleichgewichtes.


 
Ziele und Inhalte des Kurses sind:
  • Einführung in PCR, DNA-Aufbau, Polymorphismen und Mutationen
  • Suche von Sequenzen in Datenbanken, Dokumentation der Amplikone und Primer
  • Primer Design am Beispiel der Lactose-Intoleranz des Menschen
  • Erstellung eines technisches Datenblattes für das PCR
  • Genotypierungsmethoden wie: Sequenzierung, Minisequenzierung, real-time PCR, MLPA und RFLP-PCR.
  • Validierung und Hardy-Weinberg-Gleichgewicht
Protokolle und Praxis:
  • Sie erhalten Protokolle zu
    • DNA-Präparation, Standard-PCR-Ansatz
    • Reinigung des PCR-Produktes für Sequenzierungen, Minisequenzierungen oder Restriktionsverdau
    • Gelelektrophorese auf verschiedenen Systemen
    • PCR-Optimierung und Bestimmung der Nachweisgrenze eines Pathogens
  • Erstellen der Pipettierpläne
  • DNA-Präparation aus Mundschleimhautabstrich
  • Primer-Design und PCR
  • Restriktionsspaltung und Gelelektrophorese
Experimente
  • Jede Gruppe führt eine DNA-Präparation aus Mundschleimhautabstrichen durch.
  • Eine Gruppe bestimmt die Nachweisgrenze für den Nachweis von Legionella ssp. in einer Probe (limit of detection).
  • Gruppe 2 führt ein PCR für die Amplifikatin des LCT -13910-Mutation durch.
  • Gruppe 3 führt ein Allel-Spezifisches PCR für die Bestimmung des APOE-Genotyps durch.
  • Die PCR-Amplikone werden mit einem restriktionsenzym gespalten und auf einem Agarose-gel aufgetrennt.
  • Wenn Sie möchten können Sie Ihr eigenes PCR Produkt von einem Sequenzierdienstleister sequenzieren lassen und sich das Ergebnis zuschicken lassen.
    Anmerkung: Je nach Zusammensetzung der Gruppe kann das Programm abweichen.

Literatur und Download-Hinweise

  • Links zu Literatur und Downloads finden Sie in unserem Wissensportal unter Gendiagnostik.
Natürlich bleibt wie immer auch Platz für Ihre Fragen. Und wenn Sie bereits im Vorfeld Fragen haben, können Sie uns gerne ein Email schicken.
Antworten auf Fragen zur Kursorganisation und Anmeldung finden Sie hier.


>> Biuz-Artikel: Lactose-Intoleranz >> OMIM: #223100


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